DNA-Analyser av bin
Av Bo Vest Pedersen
Översättning Ulf Gröhn
Under de senaste tio åren har bruket av DNA-sekvenser visat sig vara särdeles användbart för att skilja släkter, arter, underarter (raser) åt och till och med karaktärisera enskilda indivder. Samtidigt har DNA blivit ett oumbärligt redskap för analyser av släktskapsförhållanden och till rekonstruktion av djurs och växters utveckling.
Hos djur finns två typer av DNA. Kärn-DNA, som finns i kromosomerna i cellernas kärnor och mitrokondie-DNA, som finns som ringformade molekyler i cellernas mitokondrier. Kärn-DNA finns i dubbel upplaga -. den ena hälften kommer från djurets mor och den andra hälften från fadern. Hannar (drönare) hos bin och andra steklar avviker häri genom att bara ha den portion DNA som kommer från modern. Mitokondrie-DNA (mtDNA) finns hos alla djur som kopior ärvda från djurets moder.
 |
| Figur 1. En kort DNA region, som visar de två komplementära strängarna med angivande av baser. |
DNA består av två strängar (dubbel helix), som i sin tur består av de fyra baserna G (Guanin), A (Adenin), C (Cytosin) och T (Thymin), se fig 1. Antalet och ordningen för de nämnda baserna varierar från gen till gen. Samtidigt varierar de enskilda generna från art till art. Jäför man t ex en bestämd gen eller en bit av en gen från olika arter, kommer man att finna sekvensskillnader. Fig 2 visar sålunda en jämförelse av de första 60 baserna i en sekventierad region av mtCO-I genen hos underarterna Apis mellifera ligustica, A. m. carnica, A. m. anatolica och en rad stammar hörande till A. m. mellifera.
 |
| Figur 2. En jämförelse av de första 60 baserna i den sekventerade DNA-regionen på 1407 baser i mtCO-I genen hos Apis mellifera ligustica (italienskt bi), A. m. anatolica, två stammar av A. m. carnica och 5 olika stammar av det bruna biet A. m. mellifera. Västerbotten omfattar de helt lika stammarna från Västerbotten, Umeå och Jämtland. De bruna bina från Läsö och Stockholms skärgård var också lika. Prickarna anger överensstämmelse och bokstäver anger skillnader. |
I det följande ska jag bara syssla med mitokondrie-DNA (mtDNA), som består av en cirkelformad molekyl med omkring 16 000 baspar. De olika mitokondriska generna och regionerna visas på fig 3. Användningen av mtDNA har fördelar såväl som olägenheter. Jämför man t ex en mitokondrisk gen från två arter, är mtDNA mycket lämpligt för att avslöja något om ackumulerade förändringar (mutationer), som har skett sedan de två arterna hade en gemensam urspungsform. Antalet förändringar kan grovt sagt relateras till tid. Olägenheten vid bruk av mtDNA är t ex, att det inte säger något om faderns inflytande. Hybridisering kan således inte konstateras genom ananlys av mtDNA ensamt.
 |
| Figur 3. Det ringformade mitokondriegenomet från honungsbiet Apis mellifera med angivande av de olika generna i regionen. De 22 tRNA generna visas med en svart prick på den yttre cirkeln. Stavarna till vänster visar positionen av de i detta arbete undersökta regionerna hos A. m. ligustica, carnica, anatolica och 5 stammar av A. m. mellifera. De tunna vågräta linjerna på stavarna anger positionerna av baser med skillnader karaktäristiskt för bruna bin (A. m. mellifera).De små pilarna anger skillnader, som är specifika för de aktuella stammarna. På stavarna visas också tRNA-genen och de speciella DNA-segmenten (P, Q1, Q2 och Q3) där antalet varierar. |
I en undersökning av den mitokondriska genen CO-II från olika arter av honungsbin, släktet Apis, konstaterades betydliga skillnader i bassekvenserna. Fig 4 visar ett stamträd baserat på dessa bassekvenser.
Vårt honungsbi, Apis mellifera påminner mest om (=är närmast besläktat med) det indiska honungsbiet Apis cerana. Samtidigt är gruppen Apis mellifera och Apis cerana närmare besläktat med gruppen Apis koschevnikovi + adreniformis + florea än den är med Apis dorsata + laboriosa. I stamträdet ses också en geting. Den användes som en så kallad outgroup, dvs en besläktad art som släktskapsmässigt står utanför de undersökta djursen. Tekniskt användes outgruppens DNA-sekvens i samband med analysen av och rekonstruktionen av stamträdet. Annars visar analysen klart, att det undersökta materialet består av 7 enheter eller arter förutom outgruppen. Apis laboriosa, som bara delvis är undersökt, är placerad på stamträdet utan att vara analyserad.
 |
| Figur 4. Stamträd som anger släktskapsförhållandet mellan de olika honungsbiarterna. Stamträdet är baserat på analyser av hela den mitokondriska genen CO-II (678-680 baser). Getingen (hvepsen) används som outgroup vid analysen. De sex Apis-arterna (dorsata, laboriosa, florea, andreniformis, koschevnikovi och cerana) finns endast i de sydligaste delarna av Asien, medan vårt honungsbi, Apis mellifera ursprungligen var utbrett i Afrika, Mellanöstern och Europa. |
Vårt honungsbi Apis mellifera, var ursprungligen utbrett i Afrika, Mellanöstern och Europa med undantag för de nordligaste delarna av Skandinavien. Denna utbredning omfattar områden med vitt skilda klimat-flora och landskapstyper. Det är därför inte konstigt, att honungsbiet blev uppdelat i en rad olika underarter (raser) med anpassningar till olika lokala förhållanden. Med utgångspunkt från binas morfologi och ekologi har det sålunda varit möjligt att indela Apis mellifera i 24 underarter (raser) med var sin utbredning. Fig 5 visar den ursprungliga utbredningen av de europeiska raserna. Det bruna biet, Apis mellifera mellifera, var sålunda rasen med en ojämförligt största utbredningen.
Bilden är idag för Europas vidkommande totalt förändrad, därför att biodlare har blandat raserna och framför allt föredragit det italienska biet, Apis m. ligustica. Resultatet är, att det bruna biet Apis m. m. nu blot finns i små populationer runt omkring i Nord- och Västeuropa. Ser man lite närmare på beskrivningarna av det bruna biets biologi, visar det sig, att det finns stora skillnader från område till område, något som kunde tyda på att det ursprungligen var uppdelat i en rad genetiskt olika stammar.
 |
| Figur 5 Den ursprungliga utbredningen av honungsbiet Apis mellifera och dess underarter i Europa. |
För att undersöka i hur hög grad de olika stammarna skiljer sig åt har DNA i en region på lite över 1 400 baspar i den mitokondriska genen CO-I (cytokrom oxidas I) analyserats, se fig 2. CO-I genen är en s k konserverad gen, dvs en mycket litet varierande gen. Undersöker man olika individer från samma population, finner man praktiskt taget ingen variation. Genen passar däremot väl till att undersöka och karaktärisera arter och ev underarter. Funna olikheter kan därför karaktäriseras som varande betydande.
Det undersökta materialet bestod av bruna bin från Läsö (DK), Umeå, Västerbotten, Jämtland och Stockholms skärgård (S), Derbyshire och Grimsby (GB) samt Brest (F). Utöver detta material av bruna bin blev också raserna Apis mellifera ligustica (italienska bin), A. m. carnica och A. m. anatolica undersökta.
Undersökningen av regionen i CO-I visade ( se fig 3) att de tre underarterna A.m. ligustica, A. m. carnica och A. m. anatolica var nästan lika, medan de bruna bina avvek genom att ha 20 baser olika. Dessutom visade det sig, att de bruna bina utöver dessa 20 skillnader hade skillnader som kunde relateras till de olika stammarna. På fig 3 är det med tunna horisontella linjer visat positionerna för dessa skillnader. De 20 skillnaderna är visade med tunna svarta streck, medan de olikheter, som är specifika för de olika stammarna visas med små pilar.
Fig 6 är ett försök till att beskriva släktskapsförhållandena mellan de undersökta underarterna förutom de olika bruna bistammarna baserade på undersökningarna av de 1 400 basparen i CO-I genen. På stamträdet är dessutom visat relationerna till de afrikanska underarterna och till det indiska biet Apis cerana. Skillnaden på 20 baspar motsvarande 1,4 % tyder på, att det bruna biet ha spaltats ifrån för 0,5 - 1 miljon år sedan, därför att man räknar med att skillnader på 2 % förvärvas på ca en miljon år. Detta är för övrigt i överensstämmelse med tidigare undersökningar baserade på morfologi, där man antagit att under senaste istiden honungsbiet Apis mellifera var uppdelat i tre populationer med utbredning i Mellersta Östern - Nordafrika. Under avsmältningen vandrade bin från population (1) åt norr och blev det bruna biet A- m. mellifera, bin från population (2) utvecklade sig till de mediterrana underarterna, medan population (3) spreds åt söder och blev till de afrikanska underarterna.
 |
| Figur 6. Stamträd som visar släktskapsforhållandet mellan det indiska biet (Apis cerana), de afrikanska underarterna av A. mellifera, Apis mellifera ligustica, två stammar av A. m. carnica, A. m. anatolica och 5 stammar av det bruna biet (A. m. mellifera). Den formodade evolutionära utvecklingen av det variabla området mellan CO-I och CO-II är angivet med block. Märk att stammarna från Derbyshire GB och de lika stammarna från Umeå, Västerbotten och Jämtland S har förvärvat Q-segmenten tredubbelt oberoende av varandra. |
Det bruna biet, vars utbredning efter hand kom att omfatta det mesta av Mellan- Väst och Nordeuropa, utvecklade sig efterhand till en rad stammar med speciella lokala anpassningar. DNA-undersökningarna visar tydligt, att det bruna biet kan uppdelas i en rad inbördes besläktade men karaktäristiska stammar. Skillnaderna mellan stammarna är anmärkningsvärda genom att vara större än skillnaderna mellan de mediterana underarterna (ligustica, carnica och anatolica).
Det ovan nämnda är baserat på regionen i CO-I genen. Ser man på området mellan generna CO-I och CO-II (fig 3), visar det sig, att det finns stora skillnader i det undersökta materialet. Efter CO-I genen ligger en liten gen (tRNA-gen) på 70 baspar, som finns i hela materialet. Därnäst ligger en region som varierar i längd. Denna region åter är uppdelad i mindre enheter. (P: 55 baspar, Q1: ca 50 baspar, Q2: ca 80 baspar och Q3: ca 70 baspar). Hos de mediterrana underarterna saknas P medan Q1, Q2 och Q3 varierar en smula från underart till underart.
De bruna bina avviker genom att ha P och att det efter Q1, Q2 och Q3 finns en extra portion Q1, Q2 och Q3, som sålunda är dubblerad. Helt avvikande är materialet från Derbyshire och det enhetliga materialet från Umeå, Jämtland och Västerbotten, genom att det förutom dubblering finns en extra region av Q1, Q2 och Q3. Den afrikanska grenen avviker genom mindre skillnader i P-regionen. Den förmodade utvecklingsmässiga förändringen av detta område har angivits i stamträdet. P, som ursprungligen varit med, har senare gått förlorad i den mediterrana linjen. Hos det bruna biet är Q-segmenten dubblerade. De extra dubbleringarna som finns i Derbishire materialet och i Umeå-Jämtland-Västerbottenmaterialet, anses ha uppstått oberoende av varandra. Jämförelser av CO-I genen hos de olika stammarna tyder sålunda på, att Derbyshirebina är närmare besläktade med bina från Grimsby och Brest, än de är med de svenska bina.
Undersökningarna visar tydligt på, att det bruna biet omfattar flera olika stammar, som har tydliga genetiska skillnader. Skillnaderna är t o m större än de skillnader man finner, när man jämför de mediterrana underarterna. De senaste årens diskussion om bevarandet av den genetiska mångfalden blir i fallet med det bruna biet således komplicerad av att det bruna biet består av en rad olika stammar av bruna bin. Optimala bevarandeplaner för det bruna biet kommer därför att kräva bevarandeplaner för åtskilliga stammar av bruna bin.
Litteratur:
Christensen, B., Pedersen, B.V. och Arctander, P. 1993. Det genetiske alfabet i organismernes evolution. Naturens Verden
Cornuet, J.M., Garney, L. and Solignac, M. 1991. Putative origin and function of the intergenic region between CO-I and CO-II of Apis mellifera L. Genetics 128: 393-403.
Crozier, R.H. and Crozier, Y.C. 1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organisation. Genetics 133: 97-117.
Pedersen, B.V. 1996. On the phylogenetic position of the Danish strain of the black honeybee (the Läsö bee), Apis mellifera mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) inferred from mitochodrianal DNA sequences. Ent.scand. 27: 241-250.
Ruttner, F. 1988. Biogeography and taxonomy of honeybees. 284 pp. Berlin and Heidelberg.
Willis, L.G., Winston, M.L. and Honda, B.m. 1992. Phylogenetic Relationship in the Honeybee (Genus Apis) as Determined by the Sequence of the Cytochrome Oxidase II Region of Mitochondrial DNA. Mol.Phylogetet. Evol. 1: 169-178.
Bo Vest Pedersen
Københavns Universitet
Afdeling for Populationsbiologi
bvpedersen@zi.ku.dk